上海金鵬分析儀器有限公司針對WB做不好的常見問題分析與解決方案：

問題	可能原因	驗證或解決辦法
背景較高	封閉不充分	延長封閉時間，更換合適的封閉劑(脫脂奶粉，BSA,血清等)
	一抗濃度過高	增加一抗稀釋倍數，
	抗體孵育溫度過偏高	建議4℃孵育
	二抗非特異性結合 或與封閉劑交叉反應	設置二抗對照(不加一抗),降低二抗濃度
	一抗或二抗與封閉劑有交叉反應	在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應.
	洗膜不充分	增加洗滌次數
	膜不合適	NC膜比PVDF膜背景低
	膜干燥	保證充分的反應液，避免出現干膜現象
沒有陽性條帶 或很弱	一抗、二抗等不匹配	訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬， 一抗與二抗或/和底物與酶 系統之間相匹配的抗體及底物。可通過設置內參可以驗證二級檢測 系統的有效性。
	-抗或/和二抗濃度低	增加抗體濃度，延長孵育時間
	封閉劑與一抗或二抗有交叉反應	封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20,或更換封閉劑(常用的 脫脂奶、BSA、血清或明膠
	一抗不識別目的物種的靶蛋白	檢查說明書，或做ClustalW比對，設陽性對照
	樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過 低(抗原無效)	設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中 不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標本上樣量至少每孔   20-30ug蛋白，樣本制備時使用蛋白酶抑制劑，或分級提取目的蛋白。
	轉膜不充分，或洗膜過度	使用麗春紅S檢測轉膜效果，PVDF膜需浸透，需正確的轉膜操作，勿 過度洗膜
	過度封閉	使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少 封閉時間
	一抗失效	使用有效期內抗體，分裝保存，避免反復凍融取用，工作液現配現用
	二抗受疊氮鈉抑制	所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑)
	酶和底物失效	直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了、選擇在有 效期內、有活性的酶聯物，使用新鮮的底物.
	曝光時間過短	延長曝光時間
多非特異性條 帶 或條帶位置不 對	細胞傳代次數過多，使其蛋白表 達模式的分化	使用原始或傳代少的細胞株，或平行實驗
	體內表達的蛋白樣本具有多種修 飾形式：乙酰化、磷酸化、甲基 化、烷基化、糖基化等	查文獻，使用去修飾的試劑使蛋白恢復其正確的大小
	蛋白樣本降解	使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑
	新蛋白或同族蛋白的分享同種表 位的不同剪接方式	查其它文獻報導，或BLAST搜尋，使用說明書報導的細胞株或組織
	一抗濃度過高	降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶
	二抗濃度過高產生非特異性結合	降低抗體濃度，增加二抗對照 選擇特異性更強，只針對重鏈的二抗
	抗體未純化	使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶
	蛋白存在二聚體或多聚體	SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min,